[왓슨 분자생물학] 7장 분자생물학 기법-2

7.5 핵산 분석 기본 방법

1) 젤 전기영동법

- 폴리아크릴 아마이드: 분리능력 뛰어남. 너무 큰 DNA는 분리가 잘 되지 않음

- 아가로스 젤: 분리능은 다소 떨어지나, 매우 긴 DNA도 분리 가능

- 펄스 전기장 젤 전기영동 : 전기장을 펄스로 각각의 방향으로 걸어준다. 큰유전체 분리에 사용. 클수록 회전이 느리다.

- RNA도 전기영동 확인이 가능하지만 다양한 2차, 3차 구조를 가지기 때문에 크기를 정확히 알 수 없다. RNA에 글리옥살 시약을 처리하면 크기 확인 가능

 

2) 제한효소 사용

- 제한효소의 패턴 특이성이 있어 원하는 DNA 서열 존재여부 확인 가능

 

7.6 핵산분석 응용법

1) DNA 혼성화: 이중가닥을 형성하는지 않는지를 통해 타겟 DNA를 알아낸다. 프로브도 이용

- 변성 DNA는 재생 될 수 있다.

- 혼성화는 상보서열을 지닌 두 DNA 사이의 혼성화 특이성에 의존한다 → 특정 염기서열 찾는다

- 탐침방법: DNA 5'OH에 γ인산기를 붙인다.

- 삽입방법: 프로브를 삽입한다

- DNA 조각을 찾음 : 서던블롯 혼성화 (크기를 알 수 있다)

- mRNA 조각의 양 확인: 노던블롯 혼성화 (제한효소로 절단할 필요 없음. 짧기 때문)

 

2) DNA 클로닝

- 유전자를 분자수준에서 분석하기 위해 DNA 조각을 분리 및 증폭 하기 위해 실시

- 이종 프로모터를 융합시켜 재조합 DNA를 만들면 특정 유전자 발현을 변화시킨다.

- DNA 조각을 벡터에 삽입시켜 세포 증식

- 벡터 조건: 복제개시점을 가진다. 선택표지(항생제 내성)를 가지고 있어 삽입DNA를 가진 세포를 동정할 수 있다.

                   제한효소가 딱 1곳만 자를 수 있는 단일 자리를 가진다 (이 자리에 DNA 삽입)

- 벡터 특징: 세포에 사본 수가 많다. 자연계 플라스미드보다 삽입 가능한 DNA 길이가 길다.

                    플라스미드 양에 비해 삽입 DNA를 과량 처리하면 삽입된다 (+Ca 이온도 처리)

 

3) 형질전환(Trasnformation)

- 숙주가 외부로부터 DNA를 취하는 과정

- 대장균의 세포막이 음전하를 띠어서 칼슘 Ca 처리를 하면 DNA 삽입이 가능해진다.

 

4) DNA 라이브러리

- 각기 다른 삽입 DNA를 갖는 벡터 집단 → 유전체 라이브러리

- 역전사 효소로 cDNA를 합성하며 클로닝하면 cDNA 라이브러리를 만들 수 있다.

* 역전사효소(RT) : 올리고dT 서열이 poly A tail 과 결합해 프라이머로 작용

 

5) DNA 화학적 합성

- 고형지지물 상에서 포스포아미딘(시작물질)을 사용하여 3‘→ 5’방향으로 합성. (5‘에 nt가 첨가)

- 포스포아미딘은 양성자를 지닌다. 10~100 nt를 정확히 합성 가능

- 자리-지정 돌연변이 유도 : 주문제작 올리고를 이용하여 클로닝한 DNA에 제한효소 자리를 만들고, 암호화 부위를 융합하는 등 재조합 DNA를 만든다.

 

6) 중합효소 연쇄반응 (PCR)

- 주형 DNA에 올리고를 결합시키면 3‘에 뉴클레오티드를 첨가한다. → 이중가닥 형성

 

7) 뉴클레오티드 서열분석

- 사슬-종결법 원리: 2,3-디데옥시뉴클레오티드 기질을 이용 → 사슬을 종결시킨다

- ddNTP: 당에 2번,3번 OH기가 없다. 사슬을 연장시킬 수 없다.

- ddGTP와 dGTP 비율이 1:100일 때, DNA 연장하면서 DNA Pol 이 시토신C에 도달하면 1:100 비율로 DNA 합성 중단.

- 산탄 염시서열 결정법: 유전체를 자른 후 절편의 염기서열이 겹치는 부분을 조사하여 각 조각의 순서를 정한다. 작은 게놈 염기서열을 결정할 때 사용

 

7.7 단백질 분석

1) 크로마토그래피 원리

- 일반적으로 칼럼 크로마토그래피로 분석 : 작은 아크릴아미드 or 아가로스 구슬을 채운 유리 칼럼에 단백질을 통과시켜 분리.

- 칼럼: 정지상, 고정상, 이동상(밀어주는 힘 제공) 3종류 가 필요

- 정지상 : 칼럼안에 고정되어 있는 물질. 충전칼럼, 열린관 칼럼(Capillary column)

- 크로마토그래피: 정량,정성분석에 사용. 피크의 검출시간을 통해 확인 가능

- 이온교환 크로마토그래피: 음전하를 띠고 있어 양전하를 지닌 단백질은 오래 붙어있다

- 겔여과 크로마토그래피(GFC): 단백질 크기에 따라 단백질 분리

 

2) 크로마토그래피 종류

- 이온교환 크로마토그래피(IEC): Resin(수지) 정지상 고체에 공유결합에 의해 붙어있는 음이온,양이온 그룹을 사용

                                          용질이온은 정전기적 인력에 의해 정지상에 끌린다. 이동상은 액체 (LC)

                                          구슬(고정상)과 결합한 단백질은 낮은 염농도 완충액(이동상)에서 분리된다.

                                          유출 완충액의 염농도를 점진적으로 높이면 다양한 단백질 유출,분리가 가능하다.

- 분자배제 크로마토그래피(SEC) : 젤여과 하거나, 레진(수지)를 사용하여 크기에 의해 분자들 분리 (큰분자는 통과)

                                                        정지상과 용질 사이에 인력이 없다. 세공(Pore)으로 관통)

- 친화 크로마토크래피: 정지상에 코팅된 분자와 용질분자가 붙어 이외의 분자는 통과

                                   단백질 특성을 알면 빨리 정제가 가능.

                                   이동상, 고정상을 다양하게 사용할 수 있어 다양한 분리가 가능.

                                   결합 단백질은 pH, 염 구배 변화를 통해 유출.

                                   면역 친화성 순수분리법, 항원결정기에 특이적인 이종항체를 사용하여 단백질 분리 가능.

 

3) 길이에 따른 분류

- 계면활성제 SDS(단백질에 균일한 음전하 부여)와 머캅토에탄올(환원제, S-S결합 파괴)처리하면 2,3,4차 구조가 파괴

- SDS 젤 전기영동

 

4) 면역블로팅: 웨스턴 블롯

 

5) 아미노산 서열 분석

- 에드만 분석: N 말단부터 아미노산 잔기를 떼어내는 화학반응 (유리아미노기를 PITC로 변형)

                      → 떼어낸 아미노산을 HPLC로 분석

- HPLC : 높은 압력으로 마이크로 크기의 칼럼으로 분석물질을 용리시키는 방법

              지름 1-5mm, 길이 5-30cm, 미터당 50,000~100,000 단수

              자외선 검출기가 용질을 통해 파장을 흡수한 값을 도출해낸다.

- 질량분석법 (MS) : 매우 소량의 질량을 결정. 진공상태에서 질량:전하 비율로 비행하는 원리를 이용

                            무거운 분자는 조금 비행하고 이동거리도 적다.

                            기체상(GC)에서 이온의 질량을 측정. 분자구조 파악 가능(전자공격을 받아 분자결합 파괴)

                            칼럼에서 분리되어 용출되는 용질들은 이온화 된다 → 여러 조각, 패턴이 기록됨

                            → 질량분리기로 질량/이온(m/z) 측정

                            이온화 시, 전자이온화 or 화학이온화 방법 사용

                            MS/MS는 동일 단백질 유래의 여러 펩티드 서열을 결정, 단백질 복합 혼합물을 동시에 분석가능

 

 

 

 

참고문헌 :  Watson. (2014). 왓슨 분자생물학(7판). (주)바이오사이언스출판