[왓슨 분자생물학] 7장 분자생물학 기법-1

7.0 분자생물학 기법

- 혼성화 기술: 유전자 발현을 프로브 탐침을 통해 분석함

- DNA 클로닝, PCR 로 DNA 대량생산

- 핵산-단백질 분석법

- Recombinant → 새로운 유전자, RNA, 단백질 생산 가능

 

7.1 DNA 분자의 조작과 분석

- 제한효소 : 세균 효소. 외래 유전자를 조각낸다. 자신의 DNA는 화학적 보호로 절단되지 않는다.

(ex. HaeII⋅HpaII-blunt end , EcoRI⋅HindIII⋅PastI-sticky end)

표적서열은 4-8bp 를 인식하여 절단. 항상 특정 DNA 부위를 절단

- 혼성화: DNA 이중나선 분리 → 쿨링 → 혼성화(=hybridiztion) : 특정 DNA 서열을 찾을 수 있다.

(수소결합은 비공유결합이라 쉽게 분리되지만, 뉴클레오티드 공유결합은 분리되지 않는다)

- DNA 클로닝: 복사본을 대량 생산

 

7.2 세균 DNA 클로닝

- 세포 유전체에 소량 존재하는 유전자를 물리적으로 증폭하여 분리

① 유전체를 조각으로 만든다 (제한효소)

② 절편을 재조합하여 재조합 DNA 분자를 증폭 (Ligase + ATP)

- 벡터에 DNA 절편을 삽입 → 플라스미드는 복제기점, 절단자리도 있다.

- 벡터와 DNA 절편을 공유결합으로 연결해야 한다. → 형질전환 (Transformation)

- DNA Library : 클론된 DNA 절편의 집합 (=유전체 라이브러리) 인트론+엑손

탐침을 통해 원하는 DNA를 고를 수 있다. 전체 유전체, 유전체 발현 확인

- cDNA 라이브러리: mRNA로 합성된 DNA로 클로닝.

어느시기, 특정 조건에 어떤 유전자가 발현되는지 확인 가능

 

7.3 PCR 이용 DNA 클로닝

- 세균 말고 시험관에서 수행

- 10,000 nt 이하의 짧은 DNA 클로닝 할 때 PCR 사용

- DNA 라이브러리를 만들지 않아도 된다.

- 양이 적어도 검출 가능. 법의학에서 이용됨

 

1) 염기서열 결정

- 디디옥시 염기서열 결정법: Sanger 법. 디디옥시뉴클레오시드(ddNTP) 결합시 DNA 길이 연장중단.

                                             1nt 만큼 차이나는 DNA 길이별로 전기영동상에 분리된다.

- 2세대 염기서열 결정법: PCR 증폭하여 DNA 염기서열을 한꺼번에 결정 (매우 빠름)

                                        4가지 다른 형광염료로 표지된 ddNTP를 제거,첨가해가며 형광을 읽어 염기서열을 결정

- 3세대 염기서열 결정법: 1개 DNA도 가능. 관을 통과할 때 4가지 뉴클레오티드는 각각 다른 형태를 가지고 있어

                                         받는 방해정도가 다르다 → 각 뉴클레오티드를 구별할 수 있다.

 

2) 전체적인 유전자 발현 특징 분석

- 마이크로어레이(Microarray): RNA 분석. 특정 세포나 조직에서 어떤 유전자가 발현되는지 어떤 mRNA가 만들어지는지 분석. 비용이 적다.

① cDNA를 형광염료로 표지 후, 마이크로어레이 절편과 혼성화

② cDNA 결합여부로 어떤 mRNA가 원래 시료에 존재하는지 확인 가능

 

- RNA 분석: RNA를 cDNA로 변환 후 2세대 (PCR) 염기서열결정법으로 서열 분석

 

 

 

 

 

 

참고문헌 :  Watson. (2014). 왓슨 분자생물학(7판). (주)바이오사이언스출판